細胞是生物結構和功能的基本單元，在類(lèi)型和狀態(tài)上有很大差異。在大多數生物系統中，我們對細胞多樣性的認識是不完整的，就像神經(jīng)系統（腦細胞）這樣的復雜組織[1]。單細胞識別和功能的表征，作為對每個(gè)細胞的功能和反應的理解，將加速生物領(lǐng)域的發(fā)現。它可能是癌癥、腫瘤，幾何任何可能在細胞群中具有多樣性的東西。然而，今天的技術(shù)并不能提供一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)同時(shí)分析大量的單個(gè)細胞�？焖�、可擴展的液滴測序（Drop-Seq）這種方法可以用來(lái)表征具有許多細胞類(lèi)型和狀態(tài)的復雜組織。
Drop-Seq的原理和好處
Drop-Seq是一種基于使用微流體技術(shù)的方法，通過(guò)將它們封裝在微小液滴中進(jìn)行平行分析，可以快速分析數千個(gè)單個(gè)細胞。
這些納升級水性隔離室已用于微流體器件中的許多應用：納米顆粒制造、乳液和泡沫、藥物輸送，但也作為PCR和逆轉錄的微小反應室[3]。Drop-Seq使用液滴將細胞分隔成納升大小的反應室，用于分析其mRNA轉錄物，同時(shí)使用分子條形碼策略記住轉錄物的起源細胞。通過(guò)這種技術(shù)，一個(gè)科學(xué)家每天可以制作10000個(gè)單細胞庫，實(shí)驗并行進(jìn)行且簡(jiǎn)單。因此，該方法將允許為已知細胞類(lèi)別和新的候選細胞亞型產(chǎn)生基因表達的分子圖譜。
Drop-Seq利用微流體的優(yōu)勢
（1）很短的時(shí)間內有很高的吞吐量
（2）盡量減少昂貴樣品的消耗
Drop-Seq包含以下步驟
1. 從組織中制備單細胞懸浮液
2. 準備條形碼引物（或者在微顆粒表面或者在內部）
3. 使用微流體裝置將每個(gè)細胞單獨地與一個(gè)微小條紋的微粒共同包覆或封裝在一個(gè)微小的液滴中
4. 一旦分離成液滴，裂解細胞，釋放它們的mRNA，然后與引物（primers）雜交。
5. 打破液滴并產(chǎn)生STAMP（附著(zhù)于微粒的單細胞轉錄組）
6. 放大STAMP
7. 測試和分析：使用STAMP條形碼推斷每個(gè)轉錄物的起源細胞
Drop-Seq可以使用2種beads：
A：“簡(jiǎn)單”的微粒
B：水凝膠微粒
該項工作的重點(diǎn)是“簡(jiǎn)單”微粒的使用，并簡(jiǎn)要介紹了水凝膠微粒，其原理保持不變。
Drop-Seq使用簡(jiǎn)單的微粒
1. 從復雜的組織中準備單細胞懸浮液
將復雜組織解離成單個(gè)細胞
2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每個(gè)微粒包含超過(guò)108個(gè)單獨的引物，它們共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“細胞條形碼（cell barcode）”，但具有不同的獨特分子標識符（UMI）。事實(shí)上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，這允許在STAMP形成后進(jìn)行PCR擴增。細胞條形碼，僅在相同微粒的所有引物上相同但與其他beads上的細胞條形碼不同，允許回復細胞的起源。每種引物上不同的UMI允許對mRNA轉錄物進(jìn)行數字計數并鑒定PCR duplicates。在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕獲mRNA并引發(fā)逆轉錄。
細胞條形碼的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
為了產(chǎn)生細胞條形碼，將微粒庫重復分成四個(gè)大小相等的寡核苷酸合成反應，向其中加入四個(gè)DNA堿基中的一個(gè)。然后，在每個(gè)循環(huán)后將微粒合并在一起，并進(jìn)行總共12次分裂-池循環(huán)（split-pool cycles）。結果是一個(gè)微粒庫，每個(gè)微粒具有4^12（16,777,216）個(gè)可能的DNA堿基序列之一。[4]
合成獨特的分子標識符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循環(huán)完成后進(jìn)行。將所有微粒一起進(jìn)行八輪簡(jiǎn)并合成，每個(gè)循環(huán)期間可獲得所有四種DNA堿基，使得每個(gè)單獨的引物接受4^8（65,536）種可能序列（UMI）中的一種。[5]
3. 微流體裝置
一旦單細胞懸浮液和微粒準備就緒，使用定制設計的微流體裝置將單個(gè)細胞與微粒一起包覆在液滴中。
Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton
該裝置在它們分成離散的液滴之前連接兩路水相。層流防止在液滴形成之前混合兩種水相輸入，一路流相包含細胞，另一路流相包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼引物beads。
微流體裝置
組件列表
（1）倒置顯微鏡
（2）壓力控制器+3流量傳感器/三個(gè)注射泵
（3）3個(gè)falcon管/3mL注射器
（4）磁力攪拌系統
（5）用于實(shí)驗裝置元件連接的微流體導管
（6）微流體配件和連接器
（7）PDMS共流微流體液滴生成裝置
（8）用于beads的100微米細胞過(guò)濾器
（9）用于細胞的40微米細胞過(guò)濾器
（10）計數室
實(shí)驗裝置連接示意圖
4. 細胞裂解和RNA雜交
在液滴形成后，立即將每個(gè)細胞在液滴內裂解并釋放其mRNA。然后，它們與其伴隨的微粒表面上的引物雜交。
5. STAMPS產(chǎn)生
為了一次有效地產(chǎn)生數千個(gè)STAMP，通過(guò)添加試劑來(lái)破壞液滴以使油-水界面不穩定，并收集和洗滌微粒。然后將mRNA在一個(gè)反應中一起逆轉錄成cDNA，形成一組稱(chēng)為“附著(zhù)于微粒的單細胞轉錄組（STAMPs）”的beads[6]。
6. STAMPS的放大
然后可以通過(guò)PCR反應在池（pools）中擴增條形碼化的STAMP，用于高通量mRNA測序，以分析任何所需數量的單個(gè)細胞。
7. 測序和分析
使用高容量平行測序對每個(gè)末端對得到的分子進(jìn)行測序。首先，將讀數與參考基因組比對以鑒定cDNA的起源基因。接下來(lái)，通過(guò)細胞條形碼組織讀數，并且對每個(gè)細胞中確定的每個(gè)基因的mRNA轉錄物的數量進(jìn)行數字計數。這是UMI發(fā)揮作用的地方，避免從同一mRNA轉錄物中重復計數序列讀數。隨后，可以建立數字基因表達測量矩陣（每個(gè)細胞每個(gè)基因一個(gè)測量）用于進(jìn)一步的分析。
使用水凝膠微球的Drop-Seq測序
關(guān)于水凝膠beads的使用，操作原理或多或少與以上保持相同，區別在于引物（primers），它們位于微粒內而不是位于它們的表面上。
為此，微流體裝置由三個(gè)通道而不是兩個(gè)通道組成：
（1）beads溶液一個(gè)通道
（2）細胞懸浮液一個(gè)通道
（3）需要進(jìn)行分析的化學(xué)試劑的一個(gè)通道
至于“簡(jiǎn)單微粒（simple microparticles）”的使用，水凝膠beads含有可用于逆轉錄反應的引物，然后隨后對液滴內的細胞內容物進(jìn)行條形碼編碼，由此獲得作為RNA序列的拷貝的DNA序列的集合，并且現在通過(guò)它們來(lái)自哪一個(gè)液滴來(lái)對這些序列進(jìn)行分類(lèi)。
然后，可以打破液滴并將整個(gè)細胞群作為大量樣品處理，知道每個(gè)細胞已被單獨編碼。
參考論文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.
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